arduino, eletrônica, robotica...
BioLab de Garagem
Tem uma sala vazia aqui. Poderíamos criar o BioLab de Garagem, para desenvolver projetos ligados a biologia, tipo BioDIY, BioHacking, etc.
Algum biólogo está a fim de abraçar?”
Respostas a este tópico
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Permalink Responder até ADRIANA TIEMI AKAMINE em
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Ênio...
A centrífuga que eu dizia não é tão bonita assim... rsrs
Sabe uma coisa que a gente usa no laboratório e que imagino ser fácil de fazer, tb? Um agitador de placa de ELISA.
Eu não sei se esta aqui especificamente é boa... Só para exemplificar... http://www.equipolab.com.br/produto.php?cod_produto=882412
Olá Fernando,
Realmente não é o uso mais comum para esta técnica (PCR), mas já existem estudos aplicando-a para a detecção de proteínas sim...
Não uso esta técnica no meu mestrado... Pelo visto vc tem mais familiaridade, então, nos ajude a esclarecer as dúvidas, por favor...
FERNANDO HENRIQUE SILVA disse:
PCR não é empregada para determinar proteína.
Bruno disse:Vou pesquisar a física necessária para o PCR...
Isso é para a biologia molecular e eu não estou mexendo com isso, mas coincidentemente hj eu tive uma aula sobre.... rsrsrs
Um problema é que hj em dia não se usa mais o PCR, e sim o RT-PCR (PCR em tempo real), pois é um método quantitativo também (o PCR é somente qualitativo, uns dizem semi-quantitativo, pois revela que naquela amostra há determinada proteína, por meio do peso molecular, mas não diz quanto....). O RT-PCR te dá a quantidade.... e obviamente... é um equipamento mto mais caro...
Outra dificuldade é que cada reagente usado para "quebrar o RNA no lugar certo" custa aproximadamente uns R$600....
Bom, não é minha especialidade, e não estou aqui pra botar defeito (só pra perder o desafio, rsrs)... Só quero mostrar a realidade pra tornar o negócio viável, ok?
Concordo com a filial no Ibira!!
Beijos
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Permalink Responder até Enio Benatti em
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O agitador de placa de ELISA é tão facil que da até dó.
um motorzinho CC com motoredutor e boa.
O mais dificil é a caixa (pode ser plastica ?) e a bandeja de inox.
abraço.
Enio
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Permalink Responder até ADRIANA TIEMI AKAMINE em
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Acho que sim, pode ser tudo de plástico, desde que resistente... não vejo problema... à priori...
Enio Benatti disse:O agitador de placa de ELISA é tão facil que da até dó.
um motorzinho CC com motoredutor e boa.
O mais dificil é a caixa (pode ser plastica ?) e a bandeja de inox.
abraço.
Enio
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Permalink Responder até FERNANDO HENRIQUE SILVA em
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por que o PCR não pode ser aplicado a proteínas?
a) a temperatura pra separação das fitas de DNA é de cerca de 95 oC, o que desnaturaria a maioria das proteínas
b) a unica proteína que está no meio é a TAQPOLIMERASE, que é extraida de uma arqueobactéria encontrada em ambientes do tipo geiseres ou lagos proximos a vulcões (nem formiga e mato, que encontra em qualquer lugar, lá tá purinho)
c) Pra que iria usar o termociclador se existe outros aparelhos como o espectrofluorímetro e outros muito mais especificos?
Ou seja, o aparelho de PCR (termociclador) tem somente sua viabilidade em DNA
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Permalink Responder até ADRIANA TIEMI AKAMINE em
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rsrsrs...
Meu professor falou da época qdo ainda não tinham descoberto a TaqPolimerase e eles tinham que pipetar as coisas a cada etapa, justamente pela desnaturação devido ao calor...
Sobre as proteínas, uma amiga minha explicou a utilização do PCR combinado com Western Blotting (Ah, tá!)....
Mas Fernando...
Vc acha "simples" a montagem do aparelho?
Pra mim parecia algo meio complexo... Mas pra mim, tudo o que esses meninos fazem é complexo... rsrs
Bjos!
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Para fazer o PCR , é fundamental sabermos o timing , ou seja
quanto tempo deve-se ficar a cada temperatura e mais importante que isso ,
qual a taxa de variação de temperatura necessária ,ou seja , qual o tempo maximo que pode
demorar a transição entre uma temperatura e outra.
Este dado é fator determinante para dimensionar o aquecedor/resfriador , seja ele de qual tipo for.
Outro dado importante é a precisão absoluta necessária para medição de temperatura.
Lembre-se que medir temperaturas com precisão de 1*C não é muito dificil , se for necessária maior precisão a coisa pode complicar.
Outro dado é o overshoot permitido , ou seja , ao transitar de uma temperatura para outra , quantos graus pode-se passar do ponto para depois retornar ?
Este é um comportamento comum verificado nos controladores de temperatura.
Outro dado fundamental , é o volume das amostras , quantos frasquinhos de quantos ml ?
Por enquanto é só
Abração
Enio.
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Permalink Responder até FERNANDO HENRIQUE SILVA em
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o CPra fazer um aparelho termociador, ou seja aparelho que PCR (polymerase chain reaction) e o mesmo procedimento pode ser aplicado para construção de um rt-pcr, sendo que este deverá ter um sensor que indicará o último nucleotídeo marcado.
Os principais elementos que devem ser levados em consideração são: uma rapido aquecimento até 95oC (separação das fitas) seguido de um rapido resfriamento até 50oC (anelamento dos primers) com um aquecimento rapido, porem chegando a 75oC (temperatura que a taqpolimerase fica ativa). Esses picos são para que estas variações de temperatura simulem as enzimas relacionadas com o processso de transcrição.
Os processos relacionados com northern, southern e western blot, basicamente vc não está usando o processo de PCR mas sim de cromatografia, que usam as cargas de cada uma destas moléculas para correr o conjunto de moléculas desejável.
Se perguntarem, o que seria mais facil confeccionar, entre um termociclador e um aparelho de cromatografia, eu diria, sem ponderar, que o aparelho cromatográfico é muito mais facil.
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Permalink Responder até FERNANDO HENRIQUE SILVA em
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[u][i]" qual o tempo maximo que pode demorar a transição entre uma temperatura e outra."
-Este dado é fator determinante para dimensionar o aquecedor/resfriador , seja ele de qual tipo for.
Outro dado importante é a precisão absoluta necessária para medição de temperatura.
Lembre-se que medir temperaturas com precisão de 1*C não é muito dificil , se for necessária maior precisão a coisa pode complicar.
Outro dado é o overshoot permitido , ou seja , ao transitar de uma temperatura para outra , quantos graus pode-se passar do ponto para depois retornar ?[/i][/u]
- Initialization step: This step consists of heating the reaction to a temperature of 94–96 °C (or 98 °C if extremely thermostable polymerases are used), which is held for 1–9 minutes. It is only required for DNA polymerases that require heat activation by hot-start PCR.[9]
- Denaturation step: This step is the first regular cycling event and consists of heating the reaction to 94–98 °C for 20–30 seconds. It causes DNA melting of the DNA template by disrupting the hydrogen bonds between complementary bases, yielding single-stranded DNA molecules.
- Annealing step: The reaction temperature is lowered to 50–65 °C for 20–40 seconds allowing annealing of the primers to the single-stranded DNA template. Typically the annealing temperature is about 3-5 degrees Celsius below the Tm of the primers used. Stable DNA-DNA hydrogen bonds are only formed when the primer sequence very closely matches the template sequence. The polymerase binds to the primer-template hybrid and begins DNA synthesis.
- Extension/elongation step: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used; Taq polymerase has its optimum activity temperature at 75–80 °C,[10][11] and commonly a temperature of 72 °C is used with this enzyme. At this step the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA template strand by adding dNTPs that are complementary to the template in 5' to 3' direction, condensing the 5'-phosphate group of the dNTPs with the 3'-hydroxyl group at the end of the nascent (extending) DNA strand. The extension time depends both on the DNA polymerase used and on the length of the DNA fragment to be amplified. As a rule-of-thumb, at its optimum temperature, the DNA polymerase will polymerize a thousand bases per minute. Under optimum conditions, i.e., if there are no limitations due to limiting substrates or reagents, at each extension step, the amount of DNA target is doubled, leading to exponential (geometric) amplification of the specific DNA fragment.
- Final elongation: This single step is occasionally performed at a temperature of 70–74 °C for 5–15 minutes after the last PCR cycle to ensure that any remaining single-stranded DNA is fully extended.
- Final hold: This step at 4–15 °C for an indefinite time may be employed for short-term storage of the reaction.
Este é um comportamento comum verificado nos controladores de temperatura.
Outro dado fundamental , é o volume das amostras , quantos frasquinhos de quantos ml ?
Geralmente os frasquinhos são padronizados e possuem 100 microlitros
Enio Benatti disse:
Para fazer o PCR , é fundamental sabermos o timing , ou seja
quanto tempo deve-se ficar a cada temperatura e mais importante que isso ,
qual a taxa de variação de temperatura necessária ,ou seja , qual o tempo maximo que pode
demorar a transição entre uma temperatura e outra.
Este dado é fator determinante para dimensionar o aquecedor/resfriador , seja ele de qual tipo for.
Outro dado importante é a precisão absoluta necessária para medição de temperatura.
Lembre-se que medir temperaturas com precisão de 1*C não é muito dificil , se for necessária maior precisão a coisa pode complicar.
Outro dado é o overshoot permitido , ou seja , ao transitar de uma temperatura para outra , quantos graus pode-se passar do ponto para depois retornar ?
Este é um comportamento comum verificado nos controladores de temperatura.
Outro dado fundamental , é o volume das amostras , quantos frasquinhos de quantos ml ?
Por enquanto é só
Abração
Enio.
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Muito bom ,
já temos alguns valores mas ainda faltam os tempos de transição.
quanto tempo pode levar entre o Denaturation step (20–30 segundos a 94–98 °C) e o Annealing step (50–65 °C) ?
Quanto menor este tempo maior deve ser a capacidade de refrigeração do sistema.
Como os tempos de reação são curtos de 20s a 50s creio que os tempos de transição devem ser ainda menores !
Abraço
Enio
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Permalink Responder até Victor Gonzalez em
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Aew pessoal!
Como sempre as ideias sao sempre mtu boas!
Mas querendo não ser estraga prazer , mas sendo, fazer PCR não é só isso, eu estou no momento fazendo Biologia Molecular e no próprio lab com centrifugas de 14K RPM e aparelho de PCR , professores doutores, a budega da errado, alem de que para se fazer a PCR precisa-se de varios reagentarios MTU caros, se quisermos brincar de engenharia genética precisaremos de enzimas de restrição e outras coisas, que sao coisas de tipo bemm carass.. ( e são coisas que não da para "garagear" pq precisa-se de alto nivel de pureza) >./p>
além disso fazer a centrifuga eu acho bem dificil, os tubinhos de centrifuga ( que tem nome, mas não me lembro) tem que ser postos um de cada lado para balancear, já que roda a 14 K RPM, não acho que seja facil fazer algo rodar tao perfeito assim, e o aparelho de PCR usa o mesmo tubinho da centrifuga soh que de 2uL ( 2x10^-6L), que tem todo um aparato para se aquecer uniformemente, mas basicamente o PCR eh um negocio que esquenta e esfria...
tbm tem que corar! se for fazer a eletroforese, e os corantes geralmentes sao permeaveis a membrana plasmatico, e eles se ligam ao seu DNA (já que é para ele aparecerer) e isso é cancer na certa, sem os devidos cuidados ou os produtos SAFE deles, que aposto que são bemm caros...
Tenho as aulas de Bio Mol no PC , quem quiser é só pedir tem tudo explicado , como ocorre etc, n sei se vai ser preciso conhecimentos de biologia celular primeiro, mas acho que da para entender tudo!
Posso estar falando coisas mtu erradas, mas é a minha visão da coisa...
Espero não ter desanimado ninguem, tudo isso É POSSIVEL, só que vai dar mais trabalho que o pensado!
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Permalink Responder até FERNANDO HENRIQUE SILVA em
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Seria interessante pegarmos o esquema de circuitos inntegrados
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Permalink Responder até Marcelo Rodrigues em
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Aaaaahhhh mano!!!! Essa doeu na alma!!! "Não dá para fazer", é um negócio que é difícil de digerir.
Pode até ser, mas não morreremos sem lutar!
Agora eu quero fazer esse PCR! Vou dedicar o domingo a ler sobre esse negócio. Se os caras lá do OpenPCR fazem, a gente pode fazer também! Vou postar aqui o que eu levantar.
Vamo pra cima!!!
Abraço!!
Bem-vindo a
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